厭氧氨氧化（anammox）介導(dǎo)的微生物脫氮具有成本效益，但在常規(guī)污水處理廠中累積緩慢生長的厭氧氨氧化菌十分費時。接種富含厭氧氨氧化微生物的污泥顆粒是快速建立復(fù)雜微生物氮轉(zhuǎn)化網(wǎng)絡(luò)的有效方式。本文應(yīng)用宏基因組學(xué)和宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法研究了3個代表部分硝化-厭氧氨氧化（PNA）和硝化-反硝化除氮工藝的污水處理廠接種外源anammox顆粒后的微生物脫氮效果。
結(jié)果表明，在不同的污水處理廠中，不同的活性組協(xié)同工作以實現(xiàn)有效的脫氮。證實了通過直接接種外源anammox污泥顆粒在富氨體系中應(yīng)用anammox的可行性，并從理化和組學(xué)兩個角度加深了人們對厭氧氨氧化驅(qū)動的污水處理脫氮過程中微生物氮循環(huán)的理解。
論文ID
原名：Complex microbial nitrogen-cycling networks in three distinct anammox-inoculated wastewater treatment systems
期刊：Water Research
IF：7.913
發(fā)表時間：2019年9月
通訊作者：顧繼東，李猛
通訊作者單位：香港大學(xué)生命科學(xué)院，深圳大學(xué)高等研究院
實驗設(shè)計
本文以臺灣新北市八里區(qū)（BL）和林口區(qū)（LK）及臺中文山（WS）三個不同工藝的污水處理廠接種外源氨氧化銨污泥顆粒處理為對象，采集了經(jīng)過5年穩(wěn)定運行后的活性污泥樣本并接種到改良的氨氧化微生物培養(yǎng)基中進行分批培養(yǎng)，此外基于15NO3-同位素測定厭氧氨氧化和反硝化速率。對活性污泥樣本土壤進行DNA及RNA提取，利用高通量測序技術(shù)對土壤微生物群落進行宏基因組及宏轉(zhuǎn)錄組測序。通過對功能基因進行注釋及定量其相對豐度來研究氮轉(zhuǎn)化過程與功能基因及轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的相關(guān)信息，進一步明確廢水處理系統(tǒng)中復(fù)雜的微生物氮轉(zhuǎn)化網(wǎng)絡(luò)。
結(jié)果
1厭氧氨氧化污水處理體系的建立及其脫氮性能
BL和WS是處理垃圾滲濾液的富氨污水處理廠；LK是氨氮濃度相對較低的市政污水處理廠，分別測量三個處理廠的進出水中銨、硝、BOD、COD等指標，得到污水處理廠的基本脫氮能力。在接種厭氧氨氧化污泥顆粒六個月后，在曝氣池中形成了大的厭氧氨氧化顆粒并檢測到厭氧氨氧化細菌的存在。基于15NO3-同位素素測定厭氧氨氧化和反硝化速率，結(jié)果表明：厭氧氨氧化是BL中產(chǎn)生氮氣的主要過程，在BL中不能檢測到反硝化活性。相反，反硝化作用是LK和WS的主要氮氣生成過程，同時，在WS中可以檢測到厭氧氨氧化過程。此外，三種稀釋5倍的活性污泥樣品在三天內(nèi)均可以完全氧化1毫摩爾氨。經(jīng)過一天的培養(yǎng)（圖1b），在BL（近0.6mM）中積累了大量的亞硝酸鹽，這可能是由于AOB和NOB的豐度極不平衡造成的結(jié)果。
圖1 基于15NO3-同位素測定BL, LK, WS三個污水處理廠活性污泥的脫氮及氨氧化效率。
2 基因組重建
從BL、LK和WS收集的三個活性污泥樣本上進行宏基因組和宏轉(zhuǎn)錄組測序，共產(chǎn)生了14.8億條序列和10.6億條序列，從頭組裝并進行binning共得到905個MAGs，其中196個是完整性大于80%，污染度小于10%的近完整MAGs。大部分為細菌，只有四株為古菌，分屬奇古菌門和廣古菌門。
3 氮循環(huán)相關(guān)基因的豐度與轉(zhuǎn)錄本
氨的消耗過程包括硝化作用（amo、hao和nxr）、反硝化作用（narG、nirK&S、norB&Z和nos）、厭氧氨氧化（hzs、hao和nxr）和氨同化作用（glnA）。這些氮轉(zhuǎn)化過程相關(guān)的基因豐度和轉(zhuǎn)錄水平都很高。而氨的生產(chǎn)過程，包括固氮（nifH）、硝酸鹽異化還原成銨（nrf）和尿素分解（ure），相關(guān)基因水平相對較低。此外amo和hao基因的高度表達使得氨能夠快速的被氧化消耗掉，在BL和WS中，hzs, hao 和nxr高度表達，表明厭氧氨氧化菌在積極參與脫氮過程。相比另外兩個處理廠樣本，發(fā)現(xiàn)在WS中，更多的基因參與表達，這反映了更為多樣微生物參與到了氮素轉(zhuǎn)化和去除過程。氨氮濃度相對較低的LK市政污水處理廠中氮轉(zhuǎn)化相關(guān)的功能基因和轉(zhuǎn)錄水平均低于另外兩個富氨樣本。
圖2 氮轉(zhuǎn)化過程功能基因豐度及轉(zhuǎn)錄水平對比分析。
4 脫氮相關(guān)微生物及復(fù)雜的微生物氮轉(zhuǎn)化網(wǎng)絡(luò)
硝化作用通過提供氮底物在脫氮過程中起著關(guān)鍵作用。在BL中，Nitrosomonas（BL36和BL56）是主要的氨氧化細菌（AOB），具有功能基因（amo和hao）較高的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。Nitrospira（BL254）是BL中特有的亞硝酸鹽氧化細菌（NOB），但未在其中檢測到nxr三個亞基的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。在LK中，Nitrosomonas是優(yōu)勢AOB，但未檢測到典型NOB。值得注意的是，在WS中檢測到全程硝化菌Nitrospira （WS1 10, WS238）。反硝化是一個呼吸過程，在這個過程中硝酸鹽被逐步還原為氮氣，硝酸鹽還原酶（Nar）、亞硝酸鹽還原酶（nirK/S）、一氧化氮還原酶（Nor）和氧化亞氮還原酶（Nos）是關(guān)鍵的反硝化酶。
厭氧氨氧化菌MAGs僅從處理垃圾滲濾液的富氨污水處理廠BL和WS中回收，說明厭氧氨氧化菌對底物的選擇性很強。在BL中檢測到Ca. Brocadia （BL1）和Ca. Kuenenia （BL10），在WS中檢測到Ca. Brocadia （ws118），與之前研究一致，這些菌株均過量表達，hao和hzs，Ca. Brocadia是主要的厭氧氨氧化微生物。
圖3構(gòu)建微生物氮循環(huán)網(wǎng)絡(luò)（a）氮循環(huán)過程示意，線條的粗細代表基因轉(zhuǎn)錄水平，不同的顏色代表氮轉(zhuǎn)化不同過程。（b）圓圈的大小代表MAGs、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及功能基因轉(zhuǎn)錄本的豐度差異。
4 厭氧氨氧化菌亞硝酸鹽還原酶和Hao-like蛋白
從BL和W3中得到三個厭氧氨氧化細菌MAGs（BL1、BL10和WS118），命名為“Ca Brocadia sp. BL1”、“Ca Kuenenia stuttgartiensis genome BL10”和“Ca. Brocadia sp.WS118”。在BL1中未發(fā)現(xiàn)形成亞硝酸鹽還原酶（nirS或nirK），但在WS118中發(fā)現(xiàn)了一個非常弱的nirS轉(zhuǎn)錄本。僅在兩株Ca Brocadia中發(fā)現(xiàn)了一個形成銨的硝酸鹽異化還原酶基因簇（nrf），但Nrf酶在anammox代謝中的作用尚不清楚。
圖4 三種厭氧氨氧化菌MAGs中潛在的氮轉(zhuǎn)化過程（a）氮轉(zhuǎn)化模型（b）功能基因的轉(zhuǎn)錄豐度。紅色條代表基因組豐度，深黃色條代表基因轉(zhuǎn)錄水平。
討論
香港大學(xué)顧繼東團隊: 接種厭氧氨氧化污泥顆粒的三種廢水處理系統(tǒng)中的微生物氮轉(zhuǎn)化網(wǎng)絡(luò)
本文應(yīng)用宏基因組學(xué)的方法研究了不同工藝的污水處理廠接種外源anammox顆粒后的微生物脫氮，通過結(jié)合轉(zhuǎn)錄組和基于N-15的同位素標記得到證實。結(jié)果表明在BL處理廠中，部分氨在氨氧化細菌Nitrosomonas的作用下被氧化，亞硝酸鹽和殘余的氨被厭氧氨氧化菌Ca. Brocadia和Ca. Kuenenia轉(zhuǎn)化為氮氣。在WS處理廠中，氨氧化古菌Thaumarchaeota高于氨氧化細菌Nitrosomonas。在LK富含有機碳的硝化反硝化污水系統(tǒng)中，全程硝化菌Nitrospira是主要的硝化微生物。在不同的污水處理廠中，不同的活性組協(xié)同工作以實現(xiàn)有效的脫氮。
評論
本研究通過宏基因組、轉(zhuǎn)錄組及N-15同位素標記技術(shù)，明確了不同底物環(huán)境下，污水處理廠中氮轉(zhuǎn)化過程的微生物機制及其在脫氮過程中發(fā)揮的重要作用。這些結(jié)果可以為人為在富氨體系下接種厭氧氨氧化污泥顆粒，建立厭氧氨氧化過程以及實現(xiàn)短程脫氮提供思路，并增強對其潛在微生物機制的理解，對于指導(dǎo)污水處理生產(chǎn)有重要參考意義。
