安 娜 1 , 馬晨曦 2

（1. 沈陽市環(huán)境技術(shù)評估中心，遼寧 沈陽 110011； 2. 沈陽建筑大學(xué)市政與環(huán)境工程學(xué)院，遼寧 沈陽 110168）

摘 要：厭氧氨氧化是一種以厭氧氨氧化菌的生化作用為核心的新型生物脫氮技術(shù)，具有良好的開發(fā)前景。然而由于厭氧氨氧化菌細胞產(chǎn)率極低，生長非常緩慢，且對環(huán)境條件較為敏感，使其不能很快地實現(xiàn)大規(guī)模的推廣應(yīng)用。根據(jù)厭氧氨氧化菌的生理生態(tài)學(xué)特性，從反應(yīng)器和接種污泥兩個方面綜述了近年來國內(nèi)外富集培養(yǎng)厭氧氨氧化菌的方法，并指出了今后研究的主要方向。

關(guān) 鍵 詞：厭氧氨氧化菌； 富集培養(yǎng)； 反應(yīng)器； 接種污泥

中圖分類號：X 703 文獻標識碼：A 文章編號：1004-0935（2014）06-0727-05

厭氧氨氧化（ANAMMOX-anaerobic ammonia oxidation）是一種目前在廢水生物脫氮領(lǐng)域內(nèi)備受關(guān)注的新技術(shù)，為氮素的轉(zhuǎn)化提供了一條便捷的途徑，在節(jié)能降耗方面表現(xiàn)出十分明顯的優(yōu)勢，特別是處理低碳氮比廢水，其優(yōu)越性更加顯著，因而自發(fā)現(xiàn)以來一直是國內(nèi)外研究的熱點。

厭氧氨氧化菌是厭氧氨氧化技術(shù)的核心，然而由于厭氧氨氧化菌具有如下特點使其在反應(yīng)器內(nèi)難以維持較高的生物濃度，直接制約了厭氧氨氧化技術(shù)的深入研究和工程化應(yīng)用 [1] 。一是厭氧氨氧化菌生長十分緩慢，倍增時間長（比增殖速率僅為 0.03 h -1 ，即世代時間長達 11 d），且對環(huán)境條件敏感性高(避光、嚴格厭氧、有機物等)；二是厭氧氨氧化菌生物量較低，反應(yīng)器啟動時間過長；三是在反應(yīng)過程中持續(xù)產(chǎn)生的大量 N 2 使得微生物懸浮于反應(yīng)器內(nèi)，容易造成菌種流失。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者在厭氧氨氧化菌的微生物學(xué)特性方面取得了大量的研究成果，這對于實現(xiàn)厭氧氨氧化菌的快速高效富集培養(yǎng)，進一步推動厭氧氨氧化技術(shù)的發(fā)展具有十分重要的意義。

1 厭氧氨氧化菌的特性

1.1 厭氧氨氧化菌的發(fā)現(xiàn)

早在 1977 年，奧地利理論化學(xué)家 Broda [2] 通過化學(xué)反應(yīng)自由能的熱力學(xué)計算，大膽預(yù)言自然界應(yīng)該存在反硝化氨氧化菌的假設(shè)，一種以 NO 3- -N 或NO 2- -N 為電子受體，將 NH 4+ -N 直接轉(zhuǎn)化為 N 2 的自養(yǎng)菌，但此假設(shè)一直未得到進一步的證實。直到1994 年，荷蘭 Delft 大學(xué)的 Vande Graaf 和 Mulder等 [3, 4] 證實了 Broda 的預(yù)言，他們在一個處理工業(yè)廢水的實驗室規(guī)模的三級自養(yǎng)反硝化流化床中觀察到了 NO 3- -N 和 NH 4+ -N 同時消失且成一定的比例，并伴有 N 2 產(chǎn)生的異常現(xiàn)象，他們將其稱為厭氧氨氧化。在隨后的試驗研究中進一步證明了厭氧氨氧化反應(yīng)實質(zhì)上是一個發(fā)生在微生物體內(nèi)的氧化還原過程。

1.2 厭氧氨氧化菌的分布及種類

越來越多的文獻表明，在海底沉積物、土壤的缺氧層、河底底泥、污水處理廠的活性污泥等多種環(huán)境中都有厭氧氨氧化菌存在。據(jù)估計，海洋中厭氧氨氧化反應(yīng)產(chǎn)生的 N 2 量約占全球海洋中 N 2 總量的 30%~50%，可見厭氧氨氧化菌在自然界生態(tài)系統(tǒng)的氮素循環(huán)中起著舉足輕重的作用。1998 年，Strous [4] 等首次采用 SBR 反應(yīng)器歷時 1 年的運行，獲得了純度可達 74%的厭氧氨氧化菌富集產(chǎn)物，最大比活性約 7.5×10 -4 mol-NH 4+ /(kg 蛋白·s)，并通過16S rRNA 技術(shù)鑒定厭氧氨氧化菌屬于分支很深的浮霉菌門浮霉菌目(Phylum Planctomycetes)。

由于厭氧氨氧化菌生長極其緩慢，只有在高細胞濃度時才能表現(xiàn)出活性，因此采用經(jīng)典的微生物生態(tài)學(xué)手段難以對其進行分離鑒定，迄今為止仍未獲得厭氧氨氧化菌的純系菌株。采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)—熒光原位雜交(FISH)和 PCR 擴增分析法已經(jīng)鑒定出 5 個屬 9 個種的厭氧氨氧化菌。

1.3 厭氧氨氧化菌的細胞結(jié)構(gòu)

厭氧氨氧化菌屬于革蘭氏陰性菌，大多呈不規(guī)則球狀，以出芽方式繁殖。在電子顯微鏡下發(fā)現(xiàn)細胞壁表面均布著火山口形狀的凹陷，細胞內(nèi)有特殊的分區(qū)結(jié)構(gòu)。厭氧氨氧化菌的富集培養(yǎng)物主要以生物膜或顆粒污泥的形式存在。由于富含 C 型細胞色素，高濃度富集的厭氧氨氧化污泥通常呈深紅色，性狀粘稠，在 470 nm 處具有較強的吸收峰。 厭氧氨氧化菌的細胞質(zhì)內(nèi)含有一類獨特的由單一雙分子層（膜）包裹形成的重要細胞器—厭氧氨氧化體（Anammoxsome）。厭氧氨氧化體內(nèi)含有大量的聯(lián)氨/羥胺氧化還原酶（HAO），是發(fā)生厭氧氨氧化反應(yīng)的重要場所。它的相對體積很大，約占整個細胞體積的 30%~60%。Margaret 等 [6] 認為厭氧氨氧化菌是由細胞質(zhì)、細胞膜和細胞壁三部分組成，其中細胞質(zhì)又被雙層膜分隔成厭氧氨氧化體、核糖細胞質(zhì)（riboplas）以及 pp 質(zhì)（paryphoplasm）。

1.4 厭氧氨氧化菌的生理特征

厭氧氨氧化菌是一類專性厭氧的化能自養(yǎng)型細菌。其細胞產(chǎn)率較低，在中溫（30~35 ℃）厭氧條件下，每消耗 1 g 氨氮只產(chǎn)生 0.088 g 生物質(zhì)。在35 ℃條件下，在生產(chǎn)性試驗反應(yīng)器中測得厭氧氨氧化菌的世代時間一般為 9~12 d，比生長最緩慢的產(chǎn)甲烷菌的世代時間還要長。 相關(guān)研究表明 [7] ，厭氧氨氧化菌最適宜的 pH 值和溫度范圍分別是 6.7~8.3 和 20~43 ℃，最佳生長條件為 pH=8.0、溫度為 40 ℃，此時最大比活性約9.2×10 -4 mol-NH 4+ /(kg 蛋白·s)，對 NO 2- -N 和 NH 4+ -N的親和力常數(shù)都低于 0.1 mg N/L。通常情況下，當溫度高于 45 ℃或低于 11 ℃、pH 值大于 9 或小于6.5 時，其活性將完全受到抑制。可見中溫、偏堿性的環(huán)境比較適合厭氧氨氧化菌生長。

1.5 厭氧氨氧化菌的生化反應(yīng)機理

Jetten 等 [8] 提出了厭氧氨氧化菌的生化反應(yīng)模型如圖 1 所示。

在生化反應(yīng)模型中有 3 種關(guān)鍵的功能性酶：亞硝酸鹽還原酶(NIR)、聯(lián)氨水解酶(HH)和聯(lián)氨氧化酶(HZO)。該生化反應(yīng)分 3 步進行：（1）在 NIR 的作用下，催化 NO 2- 被還原成 NH 2 OH；（2）在 HH 的作用下，催化 NH 2 OH 將 NH 3 氧化成 N 2 H 4 ；（3）在 HZO的作用下，N 2 H 4 被氧化成 N 2 并產(chǎn)生 4H + 和 4e。同時這 4e 傳遞給 NIR，開始新一輪厭氧氨氧化反應(yīng)。 最新研究發(fā)現(xiàn)在厭氧氨氧化反應(yīng)過程中，細胞質(zhì)中的質(zhì)子不斷被消耗，而厭氧氨氧化體內(nèi)會產(chǎn)生質(zhì)子，所以就形成了一個質(zhì)子梯度，這種梯度會產(chǎn)生化學(xué)能，驅(qū)動質(zhì)子由厭氧氨氧化體的內(nèi)部向外部轉(zhuǎn)移，并借助三磷酸腺苷酶（ATPase）的作用，合成三磷酸腺苷（ATP），在細胞質(zhì)中被釋放 [9] 。

2 厭氧氨氧化菌的富集培養(yǎng)方法

2.1 用于富集培養(yǎng)厭氧氨氧化菌的反應(yīng)器

由于厭氧氨氧化菌體積非常�。ㄖ睆綖� 0.8~1.1 μｍ），在普通生物反應(yīng)器內(nèi)富集培養(yǎng)極容易流失。因此，所采用的反應(yīng)器必須滿足以下條件：（1）具有高效的微生物截留性能，保證反應(yīng)器內(nèi)有足夠的適合長期富集培養(yǎng)和定量分析的的生物量；（2）抗水力負荷和基質(zhì)濃度負荷沖擊能力強，可以長時間穩(wěn)定運行；（3）盡量避免產(chǎn)生死角區(qū)或局部基質(zhì)濃度過高；（4）必須具有良好的固液傳質(zhì)性能，確保反應(yīng)底物能夠擴散到生物膜或生物絮體的內(nèi)層；（5）嚴格厭氧、避光。

目前用于富集培養(yǎng)厭氧氨氧化菌的反應(yīng)器主要包括序批式反應(yīng)器（SBR） [5，10, 23, 24，27] 、厭氧序批式反應(yīng)器（ASBR） [14, 21] 、上流式厭氧污泥床（UASB）[13, 25] 、上流式厭氧生物濾床（UAF） [16] 、生物膜反應(yīng)器 [15, 17, 20] 、推流式反應(yīng)器 [18] 、氣提式反應(yīng)器 [19] 、流化床反應(yīng)器 [4] 、固定床反應(yīng)器 [11] 等。 Wouter 等 [10] 以厭氧氨氧化顆粒污泥為接種污泥，在膜生物反應(yīng)器中成功富集出純度約為 97.6%的具有厭氧氨氧化活性的微生物，厭氧氨氧化菌在培養(yǎng)液中處于懸浮均勻分布的狀態(tài)，倍增時間僅為5 d。Toh 等 [11] 采用固定床反應(yīng)器接種澳大利亞污水處理廠的市政污泥，經(jīng)過一年的富集篩選，在載體上面成功培養(yǎng)出大量桃紅色的厭氧氨氧化菌約占88%的生物膜。

朱靜萍等 [12] 采用 SBR 反應(yīng)器接種硝化污泥，經(jīng)過 142 d 的馴化培養(yǎng)，于較高負荷下成功地富集了厭氧氨氧化菌。在穩(wěn)定運行階段,反應(yīng)器的 TN 容積負荷達到 0.43 kg N/（m 3·d），TN 去除率最高為93.3%，平均達到 80.5%；NH 4+ -N 與 NO 2- -N 去除率則分別達到 93.9%和 99.8%。污泥性狀發(fā)生較大變化，厭氧氨氧化菌大量增殖。 周少奇等 [13] 采用 UASB 反應(yīng)器接種城市污水處理廠污泥濃縮池的污泥，反應(yīng)器運行 160 d 時，在反應(yīng)器的下部形成了肉眼可見的具有厭氧氨氧化活性的褐色顆粒污泥，與文獻報導(dǎo)的厭氧氨氧化顆粒污泥為紅色不一致。順著水流方向，由下自上污泥逐漸細碎。整個富集培養(yǎng)過程中，未發(fā)現(xiàn)污泥的流失現(xiàn)象，不斷有氣泡從污泥中冒出。

李金堂等 [14] 以厭氧顆粒污泥作為 ASBR 反應(yīng)器的接種污泥，經(jīng)過 55 d 馴化后，第一次出現(xiàn)厭氧氨氧化菌活性跡象；在第 85 d 時候，厭氧氨氧化菌成為優(yōu)勢茵種；在第 140 d 時候，反應(yīng)器運行穩(wěn)定，NH 4+ -N 與 NO 2- -N 去除率分別為 60.5%和 63%，污泥顏色由灰色變成紅棕色。 李祥等 [15] 為了防止菌種流失，向 ASBR 反應(yīng)器中投加吸附性較好的纖維膜(無紡布)作為厭氧氨氧化菌的載體,將其改造成厭氧序批式生物膜反應(yīng)器(ASBBR)。在培養(yǎng)過程中，污泥顏色逐漸由灰色變?yōu)榧t棕色，最終變?yōu)闇\紅色。第 132 d 時, 反應(yīng)器TN 容積去除負荷達到 2.060 kg N/（m 3·d）。整個過程中，NH 4+ -N 與 NO 2- -N 去除率一直保持在 98%以上。

李軍等 [16] 采用 UAF 反應(yīng)器接種普通厭氧污泥成功實現(xiàn)了厭氧氨氧化反應(yīng)器的快速啟動。連續(xù)運行約 156 d 后，NH 4+ -N 與 NO 2- -N 去除率分別達到50%和55%，NH 4+ -N與NO 2- -N容積負荷達到0.72 kg N/（m 3·d）。在反應(yīng)器的下部形成了棕紅色顆粒狀污泥，與接種的黑色污泥有明顯不同。 陳勝等 [17] 采用懸浮填料填充床生物膜反應(yīng)器，接種城市污水處理廠二沉池污泥并采用好氧預(yù)掛膜低負荷培養(yǎng)法來馴化培養(yǎng)厭氧氨氧化菌群。試驗研究表明，好氧預(yù)掛膜低負荷培養(yǎng)法在較短時間內(nèi)(大約 90 d)就可以完成厭氧氨氧化反應(yīng)器的快速啟動。在穩(wěn)定運行階段，NH 4+ -N 與 NO 2- -N 去除率均接近 100%，TN 去除率超過 75%。 劉寅等 [18] 采用兩級推流式固定化絮體生物反應(yīng)器接種好氧活性污泥，成功富集培養(yǎng)出高活性的厭氧氨氧化菌。在穩(wěn)定運行階段，NH 4+ -N、NO 2- -N和 TN 平均去除率分別為 99%、98%和 85%，TN 去除負荷最高可達 2.56 kg N/（m 3·d）。反應(yīng)器內(nèi)具有厭氧氨氧化活性的污泥有紅色顆粒污泥和棕褐色絮狀懸浮污泥這兩種形態(tài)。

林豐妹等 [19] 利用氣提式內(nèi)循環(huán)反應(yīng)器經(jīng)過大約45 d 的時間，成功富集培養(yǎng)出了好氧硝化顆粒污泥。在保證 HRT 不變的前提下，通過逐步提高進水NH 4+ -N 濃度來提高反應(yīng)器的容積負荷，培養(yǎng)出的好氧硝化顆粒污泥不僅可以進行好氧氨氧化反應(yīng)，將其置于厭氧條件下培養(yǎng)一段時間以后，也同樣具有厭氧氨氧化活性。

2.2 用于富集培養(yǎng)厭氧氨氧化菌的接種污泥

菌種是生物反應(yīng)器的核心，接種污泥的選取對于厭氧氨氧化菌的富集培養(yǎng)培起著至關(guān)重要的作用。由于厭氧氨氧化菌在自然界中廣泛存在，所以利 用 不 同 的 污 泥 作 為 接 種 物 均 能 成 功 啟 動NAMMOX 反應(yīng)器。目前普遍認為成熟的厭氧氨氧化污泥是最好的接種污泥 [10，20] ，除此之外好氧污泥[21, 24] 、厭氧顆粒污泥 [21, 23] 、硝化污泥 [20] 、反硝化污泥[22] 、厭氧消化污泥 [21, 24] 、河底污泥 [25] 等與有氮素轉(zhuǎn)化功能的污泥也是良好的接種污泥。此外，也有一些研究者將上述幾種污泥的混合污泥作為富集培養(yǎng)厭氧氨氧化菌的接種污泥 [25-27] 。

黃勇等 [20] 采用 2 套相同的上流式生物膜反應(yīng)器（UBF）分別接種少量厭氧氨氧化污泥和大量硝化污泥，經(jīng)過 114 d 的運行，前者的氮去除速率由 0.23 kg N/(m 3·d)提高至 5.29 kg N/(m 3·d)，總氮去除率達到89%以上；后者的氮去除速率由 0.01 kg/(m 3·d)提高至 1.1 kg/(m 3·d)，TN 去除率達到 84.6%以上。在相同時間內(nèi)，接種少量的厭氧氨氧化污泥比接種硝化污泥能更快地實現(xiàn)厭氧氨氧化菌的富集。 路青等 [21] 采用 3 套相同的 ASBR 反應(yīng)器分別接種硝化污泥、厭氧顆粒污泥和厭氧消化污泥，分別經(jīng)過 61 d、70 d 和 85 d 的運行均獲得了厭氧氨氧化菌的富集培養(yǎng)物，NH 4+ -N 去除率分別為 82%、92%和 91%，TN 去除率達 76%、82%和 80%。試驗結(jié)果表明，硝化污泥呈絮狀但沉降性比接種前好，厭氧顆粒污泥解體后最終形成粒徑集中在 0.5~1.0 mm的污泥，厭氧消化污泥則呈沙化狀態(tài)，有細小顆粒出現(xiàn)。 張蕾等 [22] 采用將竹炭作為載體的厭氧氨氧化膨脹床反應(yīng)器接種反硝化污泥，用模擬廢水成功實現(xiàn)了厭氧氨氧化菌的富集培養(yǎng)。隨著反應(yīng)過程的推進，裝置內(nèi)的污泥性狀逐漸從深黃色絮狀污泥轉(zhuǎn)變成棕灰色顆粒污泥和紅色顆粒污泥。紅色顆粒污泥的厭氧氨氧化活性可達 0.56 mg TN/(mg protein)/h，是棕灰色顆粒污泥的 8 倍，由此推斷紅色顆粒污泥是厭氧氨氧化功能的主要承載者。

趙志宏等 [23] 在 SBR 反應(yīng)器中接種厭氧顆粒污泥富集培養(yǎng)厭氧氨氧化菌�？刂� HRT=30 d，經(jīng)過 54 d的馴化后，出現(xiàn)厭氧氨氧化現(xiàn)象，污泥由灰黑色變?yōu)樽睾稚�，粒徑減�。坏降� 90 d 時，NH 4+ -N 和NO 2- -N 的最高去除速率分別達到 14.6 g N/(m 3·d)和6.67 g N/(m 3·d)。從第 110 d 開始，逐步降低 HRT。到 156 d 時 HRT=5 d，NH 4+ -N 和 NO 2- -N 去除率分別為 60.6%和 62.5%，TN 負荷達到 34.3 g N/(m 3·d)，反應(yīng)器中形成的紅棕色顆粒污泥已經(jīng)具有相當高的厭氧氨氧化活性。

袁怡等 [24] 采用 SBR 反應(yīng)器分別接種好氧污泥和厭氧消化污泥，在相同條件下，均能培養(yǎng)出具有厭氧氨氧化活性的污泥，但是后者比前者的篩選效果好，所需時間短。厭氧污泥采用厭氧篩選法時，在pH=8.0、溫度為 35 ℃時篩選效果最佳，用時 67 d；而采用好氧篩選法時，只需短短 20 d。

沈平等 [25] 采用 2 套小試 UASB 系統(tǒng)分別接種厭氧顆粒污泥與好氧活性污泥的混合污泥和清華大學(xué)校園的河底污泥，經(jīng)過 320 d 和 246 d 的運行，均成功實現(xiàn)了厭氧氨氧化過程。NH 4+ -N 去除率分別達到 95%和 81%，NO 2- -N 去除率分別為 99.4%和88.5%。污泥性狀發(fā)生了比較明顯的變化，接種混合污泥的反應(yīng)器中富集培養(yǎng)出了厭氧氨氧化顆粒污泥。

唐崇儉等 [26] 以 50%短程硝化污泥、20%厭氧絮體污泥、20%硝化反硝化污泥和 10%厭氧顆粒污泥混合污泥作為接種污泥，在常溫(5~27 ℃)條件下，經(jīng)過 255 d 的運行，成功啟動了中試規(guī)模的厭氧氨氧化反應(yīng)器，最終容積氮負荷為 1.50 kg N/(m 3·d)，基質(zhì)氮去除速率可達 1.30 kg N/(m 3·d)。通過向反應(yīng)器中一次性投加少量厭氧氨氧化污泥(投加比 2%)，可大大加快厭氧氨氧化菌的富集進程。

林劍波等 [27] 采用 3 組平行的 SBR 反應(yīng)器分別接種厭氧顆粒污泥與好氧活性污泥的混合污泥、河底污泥與好氧活性污泥的混合污泥以及厭氧消化污泥與好氧活性污泥的混合污泥，在相同運行環(huán)境下同時運行 150~180 d 均成功啟動了厭氧氨氧化反應(yīng)器，NH 4+ -N 去除率分別達到 88%、80%和 85%，NO 2- -N 去除率均達到 96%以上。但厭氧消化污泥與好氧活性污泥的混合污泥的啟動周期更短，更加適合厭氧氨氧化菌的快速富集。

3 結(jié)束語

目前國內(nèi)外學(xué)者在厭氧氨氧化菌的富集培養(yǎng)方面進行了大量的研究，但仍處于實驗室規(guī)模階段，這也是制約厭氧氨氧化技術(shù)未能在工程實踐中得到廣泛應(yīng)用的一個關(guān)鍵性因素。從微生物的角度來講，應(yīng)加強以下兩個方面的研究：（1）改進微生物學(xué)研究方法，深入研究厭氧氨氧化菌的微生態(tài)特征以及從無機環(huán)境向有機環(huán)境過渡過程中微生物菌群的變化規(guī)律；（2）進一步研究厭氧氨氧化菌在不同環(huán)境中的生理特性及其代謝酶的特性，探尋提高其增殖速度的途徑。

參考文獻

[1] 劉金苓,鐘玉鳴,王麗嬌,等.厭氧氨氧化微生物的吸附、包埋固定化效果初探[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報,2010,30(3):470-476.

[2] Broda E.Two kinds of lithotrophs missing in nature[J].Journal of Basic Microbiology.1977,17(6):491-493.

[3] Mulder A.A.van de Graaf,Robertson L.A.,et al.Anaerobic ammonium oxidation discovered in a denitrifying fluidized bed reactor[J].FEMS Microbiology Ecology.1995,16(3):177-183.

[4] Van de Graaf, A Mulder, P de Bruijn, et al. Anaerobic oxidation of ammonium in a biologically dediated process[J]. Appl. Environ. Microbiol. 1995, 61(4):1246-1251.

[5] Strous M,Heijnen J J Kuenen J G,et al.The sequencing batch reactor as a powerful tool for the study of slowly growing anaerobic ammonium- oxidizing microorganisms [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 1998, 50: 589-596.

[6 ]MargaretR.Lindsay ， Richard I.Webb ， MarcStrous, et al. Cell compartment in planctomycetes:novel types of structural organization for the bacterial cell[J].Achives of Microbiology,2001,75(6):413-429.

[7] Van de Graaf, A Mulder, P de Bruijn, et al. Anaerobic oxidation of ammonium in a biologically dediated process[J]. Appl. Environ.Microbiol. 1995, 61(4): 1246-1251.

[8] Jetten M S M,Wagner M,Fuerst J,et al.Microbiology and application of the anaerobic ammonium oxidation（anammox）process [J].Current Opinion in Biotechnology,2001,12(3):283-288